ویروس M سیب‌زمینی (Potato virus M) یکی از ویروسهای مهم سیب‌زمینی است که گسترش وسیعی دارد. به منظور تکثیر ژنوم کامل جدایه ایرانی PVM ، ابتدا دو جفت آغازگر اختصاصی با نامهای FA/RA و FB/RB با استفاده از نرم‌افزار vector NTI v.10 طراحی شد. این آغارگرها در واکنش زنجیره‌ای پلیمراز به ترتیب قطعاتی با طولهای 4684 و 4107 جفت باز را در طول ژنوم PVM تکثیر می‌کنند. پس از تکثیر این دو قطعه، خالص‌سازی و همسانه‌سازی در پلاسمید pTZ57R ، سویه DH5α باکتری Escherichia coli انجام شد. از این پلاسمیدهای نوترکیب به عنوان رشته الگو در واکنش ‌زنجیره‌ای پلیمراز با استفاده از دو جفت آغازگر FA/RA و FB/RB استفاده شد. سپس محصولات واکنش PCR با استفاده از کیت (Qiagen, Hilden, Germany) QIAquick Gel Extraction Kit خالص‌سازی شدند و به عنوان رشته الگو برای واکنش Fusion PCR مورد استفاده قرار گرفتند. محصول این واکنش بر روی ژل آگاروز 5/1 درصد الکتروفورز و باند مربوط به ژنوم کامل (8523 جفت باز) ویروس PVM از روی ژل خالص شد. با استفاده از چندین آنزیم برشی و ایجاد قطعات مورد انتظار، صحت این قطعه تکثیری تأیید شد. سپس ژنوم کامل PVM در ناقلین دوگانه pBI 121 و pBin 61 (تحت کنترل پیشبر 35S ویروس موزائیک گل‌کلم (CaMV)، الحاق و در سلولهای باکتری E.coli سویه XL Gold همسانه‌سازی شد. انتقال سازه‌های ساخته‌شده pBI-PVM و pBin-PVM به سلولهای اگروباکتریوم سویه C5850 به روش ذوب و یخ انجام شد. جهت اثبات بیماریزایی، سازه ساخته‌شده از طریق Agroinoculation به گیاهان گوجه‌فرنگی (Solanum lycopersicum) و توتون (Nicotiana glutinosa) منتقل گردید. پس از گذشت 16 روز علائم موزائیک و زردی در برگهای جوان ظاهر شد که با انجام آزمون RT-PCR و آغازگرهای مربوط به تکثیر ژنوم کامل PVM، عفونت‌زایی سازه ساخته شده اثبات گردید. سازه ساخته شده می‌تواند در مطالعاتی مانند بررسی عکس‌العمل ارقام گیاهان میزبان در برابر ویروس و تعیین وظایف ژن ها استفاده شود.

کلمات کلیدی