مطالعه جمعیت سلول های زایا در تخمدان در حال تکوین جنین شتر مرغ معصومه خیرآبادی1، ابولقاسم نبی پور2، مرتضی بهنام رسولی1 و حسام دهقانی 3و2 1-دانشگاه فردوسی مشهد- دانشکده علوم پایه- گروه زیست شناسی 2-دانشگاه فردوسی مشهد- دانشکده دامپزشکی- گروه علوم پایه 3-دانشگاه فردوسی مشهد- پژوهشکده فناوری زیستی masoumekheir@gmail.com مقدمه: گامت‌ها از اجدادی به نام سلول‌های زایای اولیه (Primordial Germ Cells) مشتق می‌شوند. سلول‌های زایای اولیه خارج از گونادها و در طی مراحل اولیه تکامل جنینی شکل می‌گیرند و سپس در گونادهای در حال تکامل جای می‌گیرند (ستیغ جنسی) و در آن جا به اووسیت‌های اولیه در ماده و پرو اسپرماتوگونی یا گونوسیت‌ها در نر تمایز می‌یابند. سلول¬های جنسی تنها سلول بدن هستند که می¬توانند کل یک موجود جدید را تولید کنند. ا ز این لحاظ سلول¬های زایا سلول¬های بنیادی گونه¬ها هستند، چون بجای ایجاد اعضای بدن، موجودات زنده را ایجاد می¬کنند. آنها وسیله¬ای برای شکل¬گیری و تغییر گونه¬ها در طی سیر تکاملی جانداران بوده، همچنین ابزاری برای توارث بیماریهای ارثی در انسان هستند. باوجود اهمیت فلسفی و پزشکی سلول¬های زایا، اطلاعات اندکی در مورد نحوه ایجاد آنها در طی دوران تکوین جنینی، یا چگونگی تمایز آنها به سلول¬های جنسی، وجود دارد. دایسکتور روشی است که در آن تعداد ذرات در یک فضای سه بعدی مجازی که توسط دو بخش فیزیکی متوالی ایجاد شده و با فاصله مشخصی جدا شده‌اند، شمارش می‌شود. روش دایسکتورکارآمد ترین و واقعی ترین روش برآورد تعداد ذرات می‌باشد. شمارش بر روی بخش‌های موازی که با فاصله مشخصی جدا شده‌اند انجام می‌گیرد. تنها ذراتی که تنها در یکی از دو بخش متوالی ظاهر می‌شوند شمارش می‌گردند. روش کار: تخمدان های چپ جنین 20 روزه وجوجه تازه متولد شده شتر مرغ دراین تحقیق مورد استفاده قرار گرفتند. پس از انجام تکنیک های بافت شناسی و مقاطع میکروسکوپی به روش سیستماتیک تصادفی تهیه شده وباتکنیک اسید پریودیک شیف وتری کروم ماسون رنگ آمیزی گردیدند. سلول های زایا در کورتکس تخمدان بر اساس اندازه بزرگتر و محتوای گلیکوژنی بالاتر با رنگ آمیزی اسید پریودیک شیف شناسایی گردید. برای شمارش سلول‌های زایا از روش دایسکتور استفاده شد. ابتدا قطر متوسط سلول زایا به کمک میکرومتر چشمی تعیین شد. بطور متوسط قطر سلول حدود 30 میکرون بود، بنابر این از شش برش متوالی 5 میکرونی، برش اول و ششم را بررسی کردیم. سپس قاب(گرید) به صورت صفحه مربعی شفاف به مساحت یک سانتی مترمربع تهیه شد وبر روی تصویر مقطع مورد نظر قرار داده می شد. در نهایت تعداد سلول های زایا بافرمول زیر محاسبه شدند. N=(∑Q)/(∑P.a.d) = Q مجموع سلول های شمارش شده از تمام فریم ها P= تعداد کل فریم های مورد بررسی a= مساحت فریم /2 ) طول خط کش در بزرگنمایی مورد مطالعه ( d= ارتفاع بر حسب میلی متر (فاصله ی بین دو برش) نمونه برداری تصادفی ساده در مقابل نمونه برداری سیستماتیک تصادفی یکنواخت. در روش نمونه برداری سیستماتیک تصادفی یکنواخت، ساختار به ضخامت‌های ثابت (T)با شروع تصادفی(RS) ، تقسیم می‌شود. اولین برش، یک عدد کاملا تصادفی بین صفر تا T انتخاب می‌شود(9). نتایج وبحث: تصویر میکروسکوپی از تخمدان چپ جنین 20 روزه شترمرغ که با ماسون تری کروم رنگ شده است. دو بخش کورتکس(C) و مدولا (M) قابل تشخیص می‌باشد. سلول‌های مزانشیمی (Mc)سلول‌های سوماتیک ((Sc و سلول‌های زایا ( (Gcدر این شکل نشان داده شده‌اند.سلول های زایا با توجه به اندازه بزرگتر از سلول های سوماتیک قابل شناسایی می باشند. تصویر میکروسکوپی از کورتکس تخمدان چپ 20 روزه که با رنگ آلسیان – پاس رنگ شده است. سلول‌های سوماتیک ((Sc و سلول‌های زایا ( (Gcواپی تلیوم ژرمینال (E).سیتوپلاسم سلول‌های زایا واکنش پاس مثبت ضعیفی را نشان می‌دهند. تصویر میکروسکوپی تخمدان چپ جوجه تازه متولد شده که با ماسون تری کروم رنگ شده است. بافت همبند در کورتکس (Ct)، رشته‌های کلاژن در مدولا سبز رنگ شده اند. جدول 1. نتایج تخمین تعداد کل سلول‌های زایا در جنین 20 روزه تعداد کل سلول ها ی زایا ( حجم قشر × دانسیته تعدادی سلول ها) نمونه 28952/38 1 66666/65 2 33171/42 3 62538/53 4 42930/15 میانگین 27277/93 انحراف معیار جدول 2. نتایج تخمین تعداد کل سلول‌های زایا در جوجه یک روزه نمونه تعداد کل سلول‌های زایا (حجم قشر× دانسیته تعدادی سلول‌ها) 1 2/116509 2 3/141201 3 7/134554 میانگین 1/130755 انحراف معیار 4/127770 بحث ونتیجه گیری: نمودار 1. تعداد سلول‌های زایا درجنین و جوجه مرغ نمودار2. تعداد سلول‌های زایا در جنین و جوجه مرغ تعداد سلول‌های زایا در نمونه‌ها تغییرات را نشان می‌دهد که دلیل آن تفاوت‌های فردی بین نمونه‌ها می‌باشد. تعداد سلول‌های زایا در کورتکس تخمدان چپ جوجه مرغ 13 روزه 000/40 و در جوجه یک روزه 000/160گزارش شده است، به عبارت دیگر حدود 4 برابر بیشتر شده‌اند. در حالی که تعداد سلول‌های زایا شمارش شده در کورتکس شتر مرغ 42 هزار و بعد از تولد به 130 هزار افزایش یافته‌اند. به عبارت دیگر افزایشی حدود 3 برابر داشته اند. با توجه به تفاوت در زادآوری کمتر شتر مرغ ماده در مقایسه با مرغ، این تفاوت تعداد سلول‌های زایا قابل توجیه می‌باشد. لازم به یادآوری است که شتر مرغ ماده، در حدود 2 سالگی به بلوغ جنسی می‌رسد و باروری این پرنده به صورت فصلی و حدود 6 ماه در سال می‌باشد. تعداد تخم‌های شتر مرغ ماده بسته به سن پرنده، به طور متوسط 50 عدد در سال می‌باشد تعداد سلول‌های زایا در کورتکس تخمدان جوجه بطور آشکاری بیشتر از تعداد سلول‌های زایا در کورتکس تخمدان جنین 20 روزه بود. طبیعتا افزایش تعداد سلول‌های زایا ، وابسته به تقسیم میتوز و همینطور تحت فرایند آپوپتوز در طی تکوین جنینی تخمدان می‌باشد. با توجه به این که هر سلول زایا این پتانسیل را دارد تا به یک اووسیت تبدیل شود، مطالعه سلول های زایا، به لحاظ تولید بیشتر و محصولات کارآمد در صنعت پرورش طیوراهمیت بسیاری دارد. چکیده انگلیسی Study on the population of germ Cells in developing ovary of ostrich embryo Masoumeh kheirabadi a, Abolghasem Nabipourb, Morteza Behnam Rasulia b,cand Hesam Dehghani aDepartment of Biology, Faculty of Sciences, Ferdowsi University of Mashhad b Department of Basic Sciences, Faculty of Veterinary Medicine, Ferdowsi University of Mashhad c Research Institute of Biotechnology, Ferdowsi University of Mashhad Introduction: Germ cells have unique characteristic including the ability to carry genetic inheritance from parents to offspring. So, germ cells can be useful in biological development and transgenic studies. There were some studies on developing germ cell in several vertebrate specious, but very little is known about morphological development of Ostrich germ cells. Methods: The research was carried out on the left ovaries of 20 days old embryos and newly hatched ostrich chicken. After tissue processing, paraffin sections were prepared according to the systematic random sampling sections and were stained by Periodic Acid Schiff method. The dissector is a simple method that allows us to count particles under the microscope unbiased in a virtual 3D volume generated by two consecutive sections separated by a definite distance. Results: Data indicate an increase in the number of germ cells in cortex after birth relative to the embryonic period. The number of germ cells is undergoing a series of mitotic divisions and programmed cell death (apoptosis) that occurs throughout embryonic ovarian development. In the present study, germ cells were indicated only by morphological characteristics, the criteria as large cells and abundant glycogen within the cytoplasm. Using these morphological characteristics germ cells were first considered in cortex of left ovaries. Germ cells provides a potential to produce a gamet, Therefore, This approach should increase the efficiency and greater frequency in poultry industry. Key words: Germ cells- Disector method- Ovary- Ostrich منابع Basic Concepts and Practical Approaches for Estimation of Cell Number." Toxicologic pathology 38(7): 1011-1025. Bendsen, E., A. Byskov, et al. (2006). "Number of germ cells and somatic cells in human fetal ovaries during the first weeks after sex differentiation." Human Reproduction 21(1): 30-35. Boyce, R. W., K.-A. Dorph-Petersen, et al. (2010). "Design-based Stereology Introduction to González‐Morán, M. G. (2011). "Histological and stereological changes in growing and regressing chicken ovaries during development." The Anatomical Record 294(5): 893-904. Gundersen, H. and E. Jensen (1985). "Stereological estimation of the volume‐weighted mean volume of arbitrary particles observed on random sections*." Journal of microscopy 138(2): 127-142. Hewitson, T. D. and I. A. Darby (2010). Histology protocols, Springer. Kaplan, S., E. Odacı, et al. (2011). "The Disector counting technique." NeuroQuantology 10(1). Motono, M., T. Ohashi, et al. (2008). "Analysis of chicken primordial germ cells." Cytotechnology 57(2): 199-205. Myers, M., K. Britt, et al. (2004). "Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary." Reproduction 127(5): 569-580. Nagai, H., S. S. Mak, et al. (2011). "Embryonic development of the emu, Dromaius novaehollandiae." Developmental Dynamics 240(1): 162-175. Silva, C. and J. Strauss III (2006). "Differentiation of germ cells from stem cells." Vol. I: 15-30. Smith, C. A., K. N. Roeszler, et al. (2008). "Onset of meiosis in the chicken embryo; evidence of a role for retinoic acid." BMC developmental biology 8(1): 85. Tres, L. L., C. Rosselot, et al. (2004). "Primordial germ cells: what does it take to be alive?" Molecular reproduction and development 68(1): 1-4. 14.Vázquez-Nin, G. H., M. L. Escobar, et al. (2011). Embryonic Development of the Ovary, Sexual Reproduction and Meiosis. Cell Death in Mammalian Ovary, Springer: 25-48. معصومه خیرآبادی1، ابولقاسم نبی پور2، مرتضی بهنام رسولی1 و حسام دهقانی 3و2 1- دانشگاه فردوسی مشهد- دانشکده علوم پایه- گروه زیست شناسی 2- دانشگاه فردوسی مشهد- دانشکده دامپزشکی- گروه علوم پایه 3- دانشگاه فردوسی مشهد- پژوهشکده فناوری زیستی مقدمه: سلول های زایا ویژگی های منحصر به فردی از قبیل توانایی انتقال وراثت از والدین به زاده ها را دارند. بنابر این در مطالعات زیست تکوین و ترانس ژنیک حائض اهمیت می باشند. مطالعاتی بر روی سلول های زایا در چند گونه مهره دارانجام شده ولی در مورد گونه شتر مرغ اطلاعات بسیار ناچیز است. روش کار: تخمدان های چپ جنین 20 روزه وجوجه تازه متولد شده دراین تحقیق مورد استفاده قرار گرفتند. پس از انجام تکنیک های بافت شناسی و مقاطع میکروسکوپی به روش سیستماتیک تصادفی تهیه شده وباتکنیک اسید پریودیک شیف رنگ آمیزی گردیدند.سلول های زایا در کورتکس تخمدان بر اساس اندازه بزرگتر و محتوای گلیکوژنی بالاتر با رنگ آمیزی اسید پریودیک شیف شناسایی گردید. برای شمارش سلول‌های زایا از روش دایسکتور استفاده شد. دایسکتور روش ساده ایست که به ما امکان شمارش ذرات رادر یک حجم سه بعدی مجازی که توسط دو بخش فیزیکی متوالی ایجاد شده و با فاصله مشخصی جدا شده‌اند، شمارش کنیم. نتایج وبحث: تعداد سلول‌های زایا در کورتکس تخمدان جوجه بطور آشکاری بیشتر از تعداد سلول‌های زایا در کورتکس تخمدان جنین 20 روزه بود. طبیعتا افزایش تعداد سلول‌های زایا ,وابسته به تقسیم میتوز و همینطور تحت فرایند آپوپتوز در طی تکوین جنینی تخمدان می‌باشد. با توجه به این که هر سلول زایا این پتانسیل را دارد تا به یک اووسیت تبدیل شود . مطالعه سلول های زایا ، به لحاظ تولید بیشتر و محصولات کارآمد در صنعت پرورش طیوراهمیت بسیاری دارد.

کلمات کلیدی