مقدمه- گر چه روشReal-time quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR) به علت دقت، اختصاصی بودن، حساسیت و توان عملیاتی بالا یک روش استاندارد برای تجزیه و تحلیل بیان ژن می باشد، اما اگر نادرست به کار گرفته شود، نتایج آن می تواند گمراه کننده باشد. بنابراین توجه ویژه در مراحل مختلف آماده سازی و پردازش نمونه ضروری است. یکی از نکات مهم در این مقوله انتخاب ژن مرجع مناسب برای کنترل خطای آزمایش بین نمونه ها است. رایج ترین استراتژی نرمال سازی به کاربرده شده، استفاده از ژن مرجع به عنوان کنترل داخلی است که بیان آن باید در تمامی مراحل رشد و نمو یک موجود زنده ثابت باشد و تحت تاثیر تیمارهای مختلف آزمایشی قرار نگیرد. مواد و روش کار- RNA نوتروفیل ها با استفاده از کیت ستونی استخراج شد، سپس نمونه ها تا زمانی که واکنش qPCR انجام شود، در 80oC- نگهداری شدند. سطوح بیان ژن کنترل داخلی GAPDH توسط واکنش qPCR تعیین شد. درابتدا، رشته ی complementary DNA (cDNA) از total RNA هر نمونه با استفاده ازکیت ویژه سنتزشد. سپس واکنش qPCR بااستفاده از مسترمیکس سایبرگرین درحجم نهایی 25 میکرولیتر انجام شد. بعد از رسم منحنی استاندارد برای ژن GAPDH با بازده % ٩٢، بیان ژن GAPDH در گروه های آزمایشی شامل: 1- نوتروفیل های خون محیطی به تنهایی، به عنوان گروه شاهد2 - نوتروفیل های کشت توام با سلول های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان اسب3 - نوتروفیل های کشت توام با سوپرناتانت سلول های بنیادی مزانشیمی مغزاستخوان اسب و 4- نوتروفیل های تحریک شده با آب اکسیژنه سنجیده شد. نتایج- ژنGAPDH در تیمارهای مختلف آزمایش بیان نسبتا ثابتی را نشان داد. بحث و نتیجه گیری- باتوجه به نتایج، ژن GAPDH به علت بیان ثابت در تیمارهای مختلف می تواند ژن کنترل داخلی مطلوبی برای مطالعات بیان کمی ژنها در نوتروفیل های اسبی باشد که تیمارهایی از قبیل هم کشتی با سلول های مزانشیمی، سوپرناتانت سلول های مزانشیمی و آب اکسیژنه، و سایر پژوهش های سلولی- مولکولی که میزان بیان ژنهای هدف را تغییر داده است مورد استفاده قرار گیرد.

کلمات کلیدی